神经元连接的精细化与可塑性需要突触活动和神经营养因子信号传导；然而，二者的具体作用及相互影响尚不明确。本研究表明，脑源性神经营养因子（BDNF）能够增加新生大鼠海马切片器官培养体中CA1锥体神经元顶树突的树突棘密度。即使在动作电位缺失的情况下，甚至当微型突触传递被C型肉毒神经毒素（BoNT/C）抑制时鑫策略，仍能观察到该现象。但研究人员发现，在不同自发突触活动水平下，BDNF诱导的单个树突棘形态存在显著差异：在正常突触传递及河豚毒素阻断动作电位条件下，BDNF主要增加粗短型I类树突棘的比例；而当SNARE依赖性囊泡释放被BoNT/C抑制时，BDNF则显著增加细长型III类树突棘的比例。这些结果说明BDNF对树突棘密度的提升作用不依赖于突触传递水平。此外，微型突触传递可为BDNF触发的树突棘生成提供足够的功能转化基础，使其形成具有明确形态特征的树突棘类型，尤其有利于产生可能介导突触可塑性的协调钙瞬变。研究人员提出，BDNF/TrkB信号通路是实现海马形态与生理稳态可塑性的重要机制，能在广泛突触活动水平下促进更高效的突触信息传递。
关于大脑中活动依赖性结构变化可能构成学习后记忆形成基础这一假说，早在一个多世纪前便已提出。近期实验观察进一步拓展了这些观点，将其视为整个中枢神经系统突触连接精细化与可塑性的潜在机制。作为大多数兴奋性突触的突触后组成部分，树突棘因其高度动态和可塑的特性，被视为学习记忆背后持久性活动依赖性结构变化的关键位点，受到广泛关注。特别值得注意的是，研究反复证实突触活动的变化及其引发的钙瞬变会对树突棘的形成与形态产生显著影响。
展开剩余93%树突棘形态的变化被认为与突触功能及可塑性密切相关：细长颈的薄棘可能将钙瞬变与母体树突隔离；而粗短的棘则可能促进母体树突中更协调、更广泛的钙瞬变，并同步相邻棘间的钙信号。此外，具有明显头部的大棘比细长棘更稳定，且拥有更高密度的AMPA受体。然而，突触活动、树突棘形成与形态之间的精确关系仍不明确。由于神经营养素（尤其是脑源性神经营养因子BDNF）对兴奋性突触的广泛作用，它们被认为是介导中枢神经系统树突棘活动依赖性精细化的有力候选者。
在活动依赖性神经元连接精细化的经典模型（视觉经验诱导的眼优势柱形成）中，突触的强化基于其将活动转化为结构修饰的能力。这种将活动转化为适当分离的丘脑皮质投射的结构转换，由突触活动与神经营养素信号之间的相互作用介导。事实上，BDNF已被证实在发育中的视觉皮层介导活动依赖性的突触精细化，并被认为同样调控海马突触的形成。
此外，研究发现BDNF信号能促进树突棘密度与结构的改变。外源性BDNF可增加培养浦肯野神经元的棘密度，而用TrkB-IgG阻断内源性BDNF虽未降低棘密度，却增加了棘颈长度。BDNF/TrkB信号也提高了海马切片培养体中CA1锥体神经元顶树突的棘密度。进一步研究发现，视觉皮层切片培养体中锥体神经元过度表达BDNF会导致树突棘稳定性下降，表明BDNF诱导局部树突不稳定性，从而允许活动依赖性的树突棘形态变化。鉴于其对突触传递与可塑性的广泛影响，BDNF可能以类似方式调控海马（这一公认参与学习记忆的脑区）中突触连接的活动依赖性精细化。然而，BDNF信号对海马树突棘尺寸与形态的具体活动依赖性影响尚未明确。因此，本研究旨在探讨在不同突触传递水平下，BDNF对器官型切片培养体中CA1锥体神经元树突棘形成与形态的影响。
一、方法
01.海马切片培养制备
海马切片按既往方法进行无菌制备和体外培养。取出生后7天大鼠快速断头，脑组织置于冰镇Gey氏平衡盐溶液（含36 mM葡萄糖及抗生素-抗真菌混合液）中。双侧海马分离后采用定制组织切片器（使用California Fine Wire公司20微米钨丝）横向切割为500微米薄片。切片经4℃短暂孵育后，单独接种于组织培养板插入膜上，从膜下供给培养基，并于36℃、5% CO₂、98%相对湿度的培养箱中培养。培养基组成包括：最低必需培养基（50%）、Hank氏/Earle氏平衡盐溶液（25%）、热灭活马血清（20%）、L-谷氨酰胺（1 mM）及D-葡萄糖（36 mM）。为减少荧光成像自发荧光，所有培养基试剂均不含酚红。实验动物操作均遵循国际国内伦理规范，经机构动物护理使用委员会批准。
选择出生后7天大鼠海马制备器官型培养体系，旨在表征BDNF在 postnatal 海马网络中对树突棘生长与形态的作用。该培养体系中的CA1神经元能持续分化，其树突棘形态结构与突触连接特征与同龄急性海马切片具有高度相似性。
除部分切片持续使用含20%马血清的培养基外，其余培养体系在体外培养第6天起48小时内逐步滴定至无血清条件。采用无血清培养基作为对照，以消除其他生长因子和激素的潜在干扰。
02.药理处理
切片培养随机分为三组：（1）正常突触传递组；（2）电压门控钠通道阻断剂河豚毒素组（1 μM）；（3）囊泡神经递质释放抑制组（使用可切割SNARE蛋白复合物成员syntaxin-1A的C型肉毒神经毒素100 ng/ml）。所有处理均在无血清对照培养基预培养24小时后，于体外培养第9天开始。各组分别在毒素存在/不存在条件下用BDNF（250 ng/ml）处理48-72小时。为验证BDNF作用特异性，部分培养持续使用含20%马血清的对照培养基11天。
选择体外培养第9天开始处理，旨在避免过度轴突发芽导致的网络活动异常。本处理方案与既往BDNF对突触结构与功能影响研究保持一致。
03.电生理记录
采用全细胞电压钳技术记录微型兴奋性突触后电流。通过红外微分干涉对比成像在固定载物台正置显微镜下识别培养11-12天的CA1锥体神经元。切片持续灌注含124 mM NaCl、2 mM KCl、1.24 mM KH₂PO₄、1.3 mM MgSO₄、17.6 mM NaHCO₃、2.5 mM CaCl₂、10 mM D-葡萄糖的人工脑脊液（渗透压用蔗糖调节至310 mOsm/L，持续通入95% O₂/5% CO₂）。为记录AMPA介导的mEPSCs，人工脑脊液中添加0.5 μM TTX、80 μM D-APV和50 μM印防己毒素。为后续树突棘可视化，在膜片电极内加入荧光染料Alexa-594。电极内液包含：0.132 mM Alexa-594、120 mM葡萄糖酸铯、17.5 mM CsCl、10 mM NaCl、10 mM Na-HEPES、0.2 mM EGTA、2 mM Mg-ATP、0.2 mM Na-GTP、20 mM QX-314（pH 7.2，渗透压280-290 mOsm/L）。未抛光电极阻抗为8-10 MΩ，全细胞记录时接入电阻<25 MΩ，电容约110 pF。膜电流信号经放大器采集后，用自定义软件进行数字化记录（采样率4 kHz），离线数据通过Mini-Analysis程序分段分析。
04.树突棘成像
全细胞记录15-20分钟后轻柔移除电极，切片在4%多聚甲醛中室温固定过夜，PBS漂洗后封片。使用激光共聚焦显微镜和100倍油镜对CA1锥体神经元顶树突的远端分支进行成像。通过氪激光激发Alexa-594荧光，采集0.1 μm间隔的Z轴光学切片序列并存储供分析。
05.树突棘密度与形态分析
为克服光学显微镜分辨率限制，严格选择最表层的锥体神经元（树突段距切片表面<30 μm）。虽然观测可能偏向大型树突棘，但各处理组间偏差恒定鑫策略，不影响相对比较的有效性。树突棘定义为母树突延伸≤3.0 μm的突起，长于3.0 μm的丝状伪足不计入分析。图像栈经三维重建后沿树突轴旋转验证，最终采用最大强度二维投影进行测量。使用ImageJ软件测量树突段长度与棘形态，横向像素分辨率为0.09 μm。棘密度通过单位树突长度上的棘数量计算，归一化为每10 μm树突的棘数。
06.棘分类标准
采用Peters分类法将树突棘分为三型：粗短型（I型）长度与颈径、头径相近（通常≤1 μm）；蘑菇型（II型）长度通常≤1 μm且颈径远小于头径；细长型（III型）长度多>1 μm且远大于颈径。分类依据棘长度L、最大颈径dn和最大头径dh的比值关系（图1示测量参数及典型树突段）。各形态类别棘的数量按占总棘数比例进行统计比较。
图1. 树突棘类型分类
该分类基于棘的长度、头部直径和颈部直径
采用SPSS统计软件进行数据分析。数据以均值±标准误表示，运用方差分析、Tukey多重比较检验及独立样本t检验进行统计处理，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
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二、结果
01.BDNF能增强mEPSC频率、提升树突棘密度与尺寸、并促进粗短型I类棘形成
在无血清培养基中对培养11-12天的海马切片长期（48-72小时）施加BDNF（250 ng/ml），可显著增加CA1锥体神经元AMPA介导的mEPSC平均频率（从0.3±0.09 Hz提升至0.69±0.07 Hz，P < 0.01），但不影响其振幅（对照组11.41±1.5 pA vs BDNF组12.84±0.8 pA，P = 0.428）。通过全细胞记录后的成像分析发现，BDNF同时显著提高了顶树突次级与三级分支的棘密度（BDNF组每10微米树突9.46±0.22个棘 vs 对照组6.87±0.22个棘，P < 0.001）。这些结果证实BDNF既能增强量子化突触传递，又能促进树突棘形成。
图2. 在正常神经元活动条件下，BDNF可增加AMPA-mEPSC频率与树突棘密度，同时促进粗短型棘（I型）形成
A. 在无血清对照组（左）和脑源性神经营养因子处理组（右）海马切片培养中，CA1锥体神经元记录到的AMPA介导的mEPSC平均振幅概率分布。插图为各组自发mEPSC的平均频率、振幅及代表性连续记录
B. 无血清对照组（左）、BDNF处理组（中）和20%马血清处理组（右）切片培养中，填充Alexa-594的CA1锥体神经元顶树突代表性片段的最大强度Z轴投影共聚焦图像
C. 对照组、BDNF处理组和20%马血清处理组切片培养中各形态类型棘（I型、II型和III型）比例的柱状图。本图及后续所有图中，星号表示具有统计学显著性的差异（P < 0.05）
鉴于突触活动变化会影响树突棘形态，且BDNF已显示可增强突触活动，研究人员进一步分析了BDNF对棘形态的影响。根据棘长度、颈径和头径的测量参数，将树突棘分为粗短型（I类）、蘑菇型（II类）和细长型（III类）。研究发现，与无血清对照组相比，BDNF显著提高了粗短型I类棘的比例（对照组0.39±0.04 vs BDNF组0.62±0.03，P < 0.01），降低了蘑菇型II类棘比例（0.38±0.03 vs 0.23±0.02，P = 0.002），但对细长型III类棘比例无显著影响。同时，BDNF还引起树突棘的肥大性改变，显著增加了棘的长度、颈径和头径（P < 0.05）。这些形态学改变表明BDNF可能通过促进棘内及其对应树突区的同步化钙信号来影响突触可塑性。
为验证BDNF作用的特异性，研究人员比较了含20%马血清培养基培养的神经元。该组虽呈现最高棘密度（每10微米11.17±0.36个棘），但其棘类型比例与无血清对照组相似鑫策略，且棘尺寸无显著差异。这表明BDNF对树突棘生长和形态的调控并非简单的营养支持作用，而是特异性促进个体棘生长及粗短型I类棘的形成。
图3. 不依赖动作电位的神经递质释放（微型事件）为BDNF诱导树突棘形成并提供充分活性，并优先增加粗短型棘（I型）比例
A. TTX处理（左）与TTX–BDNF处理（右）切片培养体中AMPA介导的mEPSC平均振幅概率分布
B. TTX处理（上图）与TTX–BDNF处理（下图）切片培养体中CA1锥体神经元的代表性树突段
C. TTX与TTX–BDNF处理切片培养体中各形态类型树突棘比例柱状图。为便于直观比较，图中同时展示无血清对照组数据（源自图2）
02.自发性动作电位非依赖性突触传递为BDNF促进树突棘形成与形态改变提供充分条件
为排除BDNF通过增强全切片突触传递间接影响树突棘的可能性，研究人员使用TTX阻断动作电位进行验证。长期TTX处理使mEPSC频率和振幅均较无血清对照组显著升高（P < 0.05）。在此条件下，BDNF可降低mEPSC平均振幅（TTX组17.92±1.9 pA vs TTX-BDNF组11.82±0.8 pA，P < 0.05），但不影响其频率。重要的是，TTX存在时BDNF仍能显著提升树突棘密度（TTX-BDNF组每10微米8.97±0.20个棘 vs TTX组6.46±0.17个棘，P < 0.001）。
神经元活动阻断同时影响棘形态：长期TTX处理使III类棘比例增加，II类棘比例减少，而BDNF在TTX存在条件下仍能显著提高I类粗短棘比例（TTX-BDNF组0.58±0.06 vs TTX组0.30±0.05，P < 0.001），降低III类细长棘比例，并引起棘长度减小和颈径增大。这些结果与正常突触传递条件下的发现一致，表明自发性动作电位非依赖性突触传递已为BDNF调控棘形态提供充分条件。
图4. 在几乎不存在SNARE依赖性神经递质释放的条件下，BDNF诱导树突棘形成并增加细长型棘（III型）比例
A. 采用C型肉毒神经毒素（BoNT/C）处理（左）及BoNT/C–BDNF联合处理（右）的切片培养体中AMPA介导的mEPSC平均振幅概率分布
B. BoNT/C处理（上图）与BoNT/C–BDNF处理（下图）切片培养体中CA1锥体神经元的代表性树突段
C. BoNT/C与BoNT/C–BDNF处理切片培养体中各形态类型树突棘比例柱状图。为便于直观比较，图中同时展示无血清对照组数据（源自图2）
03.SNARE介导的神经递质释放缺失条件下BDNF仍促进棘形成并增加细长型III类棘比例
为彻底排除突触前功能的影响，研究人员使用BoNT/C切割SNARE蛋白syntaxin-1A以阻断囊泡释放。该处理使mEPSC频率下降30倍（P < 0.05），而残余mEPSC振幅显著增大。在此近乎完全阻断突触传递的条件下，BDNF虽未能逆转mEPSC频率的抑制，但仍可显著提升CA1锥体神经元的棘密度（BoNT/C-BDNF组每10微米8.33±0.33个棘 vs BoNT/C组5.89±0.21个棘，P < 0.001），证明BDNF通过突触后机制触发棘生成。
形态学分析显示，BoNT/C单独处理增加I类棘比例，降低II类棘比例。而当BDNF与BoNT/C共同作用时，则显著提升III类细长棘比例（BoNT/C-BDNF组0.38±0.02 vs BoNT/C组0.11±0.05，P < 0.05），降低I类粗短棘比例，同时减小棘颈径和头径。这表明在SNARE介导的突触传递几乎完全缺失时，BDNF诱导形成的树突棘以III类细长型为主。
综合以上发现，BDNF与自发性微型突触传递的协同作用促进CA1锥体神经元树突棘的形态重塑。在此条件下占主导的粗短型棘可能通过其几何特性，在母体树突和相邻棘间产生协调、广泛的钙瞬变，从而在钙依赖性突触可塑性（如长时程增强）中发挥关键作用。
三、讨论
基于树突棘高度动态和可塑的特性，它们一直是探索中枢神经系统活动依赖性结构修饰的重要研究对象。本研究证实，长期施加BDNF不仅能促进树突棘形成，还能在动作电位依赖性和非依赖性突触传递条件下提高粗短型（I类）棘的比例。即使在BoNT/C抑制SNARE依赖性囊泡突触传递的情况下，BDNF仍能诱导棘形成，不过此时形成的棘以细长型（III类）为主。值得注意的是，用内源性BDNF清除剂TrkB-IgG阻断BDNF信号后，小脑浦肯野细胞的棘长度增加，形态与本研究所述的III类细长棘相似。这些发现与突触形态分化的活动依赖性过程一致，表明BDNF通过与自发性微型突触活动相互作用，精细调控出生后海马CA1锥体神经元的树突结构。
在正常动作电位依赖性突触传递条件下，BDNF能同时增加粗短型（I类）和蘑菇型（II类）棘的比例。而自发性动作电位非依赖性突触传递（微型事件）已为BDNF发挥结构调控作用提供足够的突触活动基础。在TTX阻断动作电位的条件下，BDNF仍能提高总棘密度和粗短型棘比例，同时降低细长型棘比例。考虑到细长棘可能隔离棘内钙信号与母树突及其他棘的通信，而协调的棘钙瞬变被认为是突触可塑性的必要条件，我们提出BDNF不仅通过增加棘密度，还通过特异性促进更有利于广泛钙信号传递的棘类型来增强突触可塑性。
关于棘几何形态与突触活动水平的关系，研究支持钙水平与棘生长的钟形关系模型：极低和极高的钙水平抑制棘生长，中等钙水平则促进棘形成和伸长。与此一致，长期TTX处理虽未影响棘密度，但增加细长型棘比例。当仅有微型突触传递与BDNF信号共存时（TTX-BDNF组），微型传递为BDNF将树突棘从细长型重塑为粗短型提供充分的活动基础。
另一个重要发现是，即使在SNARE介导的突触传递几乎完全缺失时，BDNF仍能提升棘密度，但此时主要增加细长型棘比例。这一形态效应可能源于BDNF通过TrkB激活磷脂酶C，促使IP3储存库释放钙，引发中等水平钙信号所致。研究表明，突触形成并不依赖SNARE介导的神经递质释放，这与缺乏囊泡融合必需蛋白munc-18的突变小鼠发育过程中的观察一致。虽然树突棘本身不能代表完整突触的存在，但我们的数据表明BDNF能在缺乏囊泡神经递质释放的情况下促进突触形成，或至少促进突触后结构的发育。在发育过程中，BDNF的释放可能作为一种化学导向信号，以不依赖神经递质释放的方式引导树突棘形成，从而促进突触建立。
尽管部分树突棘仍然存在，但使用BoNT/C长期抑制囊泡神经递质释放会降低CA1神经元顶树突的棘密度，且不影响各形态类别棘的比例。在突触前功能几乎完全缺失的条件下，BDNF仍能提升棘密度，这表明棘形成是突触后神经元的固有特性，而棘的维持则需要突触前输入的支持。这一固有特性的最初证据来自对浦肯野细胞的研究：当攀爬纤维输入被移除后，这些细胞仍能形成新的树突棘。此外，培养的神经元在接收突触前输入之前就会形成树突丝状伪足（树突棘的前体）。我们在无神经递质释放条件下观察到的BDNF诱导棘形成现象表明，BDNF通过增强突触后细胞的固有特性来促进棘形成。然而，在此条件下形成的棘与BDNF联合自发性微型突触传递所形成的棘在形态上存在显著差异。
由于BDNF能够在SNARE介导的释放缺失且不影响mEPSC频率的条件下提升棘密度，说明BDNF促进棘形成的过程不依赖于神经递质释放；不过这些棘多为细长型（III类）。然而，神经递质释放在BDNF诱导的个体棘结构精细化中起着关键作用。在自发性动作电位依赖性和非依赖性突触传递存在时，BDNF能增加粗短型（I类）棘的比例。仅从形态学观察来看，在BDNF作用下，正常（动作电位依赖性）与TTX（动作电位非依赖性）处理条件下个体突触的突触激活水平可能并无本质差异；这很可能是因为海马突触每个活动区每次动作电位最多仅释放一个囊泡。
长期TTX阻断神经元活动会提高培养海马神经元mEPSC的频率和振幅，这种效应被视为"突触缩放"或稳态可塑性的一种形式。有趣的是，BDNF/TrkB信号被证明可介导此类稳态可塑性。与本研究中观察一致，BDNF阻断了TTX处理海马切片CA1锥体神经元mEPSC振幅的升高。长期抑制SNARE依赖性囊泡神经递质释放同样会提高残余mEPSC的振幅，在此条件下BDNF虽未显著改变mEPSC振幅，但呈现出减小趋势。
尽管难以建立确切的因果关系，但多种神经疾病与树突棘病理异常相关，尤其多见于智力障碍患者。值得注意的是，在递质释放缺失条件下由BDNF诱导产生的棘（BDNF–BoNT/C组）与唐氏综合征和脆性X综合征患者中观察到的弯曲细长棘形态相似。这些发现提示，BDNF信号与自发性微型递质释放的相互作用不仅促进更适于钙依赖性突触可塑性的棘形成，也可能对人类认知相关皮层网络的结构分化具有重要意义。
图5. BDNF在不同突触传递水平下诱导树突棘形成并特异性调控其形态成熟
A. 从无血清对照组(1)、BDNF组(0)、TTX组(9)、TTX–BDNF组(8)、BoNT/C组(ª)和BoNT/C–BDNF组(•)海马切片培养的CA1锥体神经元获得的所有记录的AMPA-mEPSC振幅（左）和频率（右）的累积概率分布
B. 散点图显示各处理组顶树突每10 µm长度中I型(•, 实线)、II型(0, 虚线)和III型(8, 点线)树突棘的平均数量，并呈现为对照组与BDNF、TTX与TTX–BDNF以及BoNT/C与BoNT/C–BDNF的比较。各棘类型密度之和即为总棘密度（T），以次级和三级顶树突每10 µm的平均棘数表示
我们通过CA1锥体神经元的生理学与形态学综合研究证明：BDNF提升棘密度的作用不依赖于突触传递水平；微型突触传递为BDNF触发的棘形成过程转化为特定形态类型提供充分的功能基础。因此我们认为，BDNF作为突触结构与功能的稳态调节因子，维持海马兴奋性突触的最佳信息传递。这些突触层面的作用不仅构成BDNF在细胞水平调控突触可塑性的基础，也可能解释BDNF信号在海马依赖性学习记忆中的关键作用。
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